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厄貝沙坦、阿司匹林單獨及聯合作用對MCA鼠模型腦損傷影響的觀察

厄貝沙坦、阿司匹林單獨及聯合作用對MCA鼠模型腦損傷影響的觀察



李春華1,王曉東2,朱予津2,王 正2,嚴子平2,劉長勝2

(武警天津總隊醫院:1.內科;2.藥械科,天津  300162)

 

要:【目的】利用MCAO 模型大鼠研究厄貝沙坦IRB)、阿司匹林ASP)在腦卒中後對腦組織的影響。【方法】雄性Wistar 大鼠40 隻隨機分為5 組:MCAO,IRB+MCAO,ASP+MCAO,IRB+ASP+MCAO,正常對照。連續給藥7 d 後,I-IV 組行MCAO 術,24 h後觀察行為、梗塞容積、生化指標,SPSS16.0 處理實驗數據。【結果】預防性給予IRB、ASP 的大鼠與單純MCAO 大鼠比較,自發活動率、抓力、過氧化氫酶水平呈上升趨勢,梗塞容積、TBARS  水平呈下降趨勢P<0.05)。【結論】IRB  ASP  有改善腦卒中後腦損傷的作用,聯合用藥效果更為顯著。

 

關鍵詞:腦卒中;MCAO 大鼠模型;厄貝沙坦;阿司匹林

【文章編號】2095-3720(2013)04-0252-04 【中圖分類號】R965 【文獻標誌碼】A

 

  腦卒中是嚴重危害人類健康和生命安全的常見的難治性**1,存在著明顯三高(發病率高、致殘率高、死亡率高)現象,已得過腦卒中的患者,還易再複發,每複發一次,加重一次。所以,急需采取有效措施預防腦卒中的發生。厄貝沙坦(Irbesartan,IRB)為血管緊張素Ⅱ受體抑製劑,能特異性地拮抗血管緊張素轉換酶1 受體,抑製血管收縮和醛固酮的釋放,產生降壓作用2。阿司匹林(Aspirin,ASP)是一種抗風濕曆史悠久的解熱鎮痛藥,具有解熱、鎮痛、**、抗風濕和抗血小板聚集等多方麵的藥理作用3]。本實驗擬通過觀察大鼠的行為、梗塞容積、生化指標來了解IRB ASP 降低腦卒中後腦損傷的效果,並探討聯合用藥是否具有事半功倍的療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

  藥品及試劑:IRB(上海雅吉生物科技有限公司,100 mg),ASP(上海恒遠生物科技有限公司,200 mg),0.5%CMC-Na、SDS(任丘市華燕化工產品有限公司)。TBARS 試劑盒(SAT-330),過氧化氫酶試劑盒SAT-341)購於Cell Biolabs Inc。

1.1.1 儀器:MCAO (2636-50,北京沙東生物技術有限公司),自發活動視頻分析係統和大小鼠抓力測定儀(DB018,DB025,北京播放高清视频不卡的播放器生物科技有限責任公司),病理圖像分析儀(DMR+Q550,德國萊卡),酶標分析儀Thermo Scientific Multiskan FC  ,美 ,轉 儀(Bio-rad Trans-Blot,美國伯樂)。

1.1.2 動物:健康雄性清潔級Wistar 大鼠由軍事科學院實驗動物中心提供,體重250~300 g,籠養,動物質量合格證書編號SCXK-(軍2002-001。

1.2 

1.2.1 實驗分組及給藥:將大鼠隨機分為5 組,每組隻。第組,建立單純右側大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO) 模型,灌胃0.5%CMC 溶液5 ml;第2 組建立MCAO 模型之前灌胃給予IRB(IRB  0.04 g/ml 溶於 0.5% CMC-Na 液)5 ml;第3 組,建立MCAO 模型之前灌胃給予ASP(ASP 0.08 g/ml 溶於0.5% CMC-Na溶液)5 ml;第4組,建立MCAO 模型之前給予IRB+ASP(體積各半 5 ml;第組為正常對照組灌胃 0.5% CMC 溶液 5 ml。定時經口腔灌飼液體,1 /d,連續7 d。*後一次給藥3 h 後第1~4 組建立MCAO 模型,建模2 h 恢複灌注22 h,隨即監測自發活動與握力,然後處死大鼠,取出腦組織檢測梗死容積、TBARS、過氧化氫 酶水平。

1.2.2 MCAO模型製備:大鼠麻醉(水合氯醛400 mg/ kg,經腹腔注射)後仰臥位固定於手術台上,行頸前正中切口分離並暴露右側頸總動脈,再向頭端分離出頸外動脈及頸內動脈,結紮頸外動脈,並分離出頸內動脈顱外段分支翼齶動脈,夾閉其近端。在頸外動脈根部剪口,將MCAO 線經頸外動脈逆向插入頸內動脈,到達大腦前動脈近端,作為栓塞成功標記4]。

1.2.3 自發活動率和抓力測量:利用自發活動視頻分析係統和大鼠抓力測定儀對大鼠逐一進行自發活動與抓力測試。

1.2.4  梗塞容積計算:將大鼠斷頭取腦並速凍後自視交叉向後作厚約2 mm 的連續切片片,置於2% 氯代三苯基四氮唑Triphenyltetrazolium chloride,TTC)緩衝液中,37℃避光孵育30 min。采用病理圖像分析儀的軟件分析係統計算每張冠切片的腦梗塞麵積,根據麵積和切片間隔計算腦片上梗塞灶體積占全腦體積的百分比4,見圖1。



1.2.5 硫代***酸活性物質分析Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS):PBS 溶液衝洗新鮮腦組織樣本,低溫下製得組織勻漿。4℃,10 000 r/min 離心 5 min,收集上清。按2:2:5 的比例依次加入樣品、SDS 裂解液、TBA 稀釋液。95℃水浴 50 min,冷卻後3 000 r/min 離心15 min。使用酶標分析儀測定532nm 處光吸收度。

1.2.6 過氧化氫酶分析:PBS 溶液衝洗新鮮腦組織, 低溫下製得組織勻漿。4℃ 10 000 r/min 離心 15 min 收集上清,利用Western Blot 檢測樣品中過氧化氫酶水平,IPWin6.0 軟件分析Western Blot 結果。

1.2.7 統計方法:本實驗中所有數據采用SPSS16.0 統計軟件分析,采用單因素方差分析和LSD 檢驗分析IRB ASP MCAO 模型大鼠的影響,應用簡單方差分析檢驗IRB  ASP  有無交互效應。數據以( ±s)形式表示,P<0.05 具有統計學意義。

2.1 IRB,ASP,IRB+ASP MCAO模型大鼠自發活動率的影響

每隻大鼠置於暗室之中通過軟件記錄10 min 內的自發活動次數。正常大鼠10 min 的自發活動率為289.88±22.93)次,第1 組大鼠10  min 的自發活動率(22.63±2.83)次嚴重降低(P<0.05),而第4組大鼠 10 min 的自發活動率則保持在較高水平199.75±6.84)次,第組與第組介於二者之間。見表1。

2.2 IRB,ASP,IRB+ASP MCAO 模型大鼠抓力的影響

正常大鼠的抓力約為(0.64±0.12)kg/U,施行 MCAO 手術後,所有大鼠抓力均有不同程度下降,第4 組大鼠降至(0.39±0.01)kg/U,第2 組與第組大鼠則分別(0.23±0.05)、(0.20 ±0.02)kg/U,第下降*為明顯,僅剩0.07 ±0.01)kg/U。見表1。

2.2 IRB,ASP,IRB 聯合ASP MCAO 模型大鼠梗塞容積的影響

組大鼠的大腦梗塞容積高達296.87 ± 24.10)mm3,第(159.72 ± 15.98)mm3 與第(164.09±17.64)mm3 則低於第1 組,而第組大鼠的梗塞容積*少僅(71.91±13.42)mm3。見表1。

正常大鼠的抓力約為(0.64±0.12)kg/U,施行 MCAO 手術後,所有大鼠抓力均有不同程度下降,第4 組大鼠降至(0.39±0.01)kg/U,第2 組與第組大鼠則分別(0.23±0.05)、(0.20 ±0.02)kg/U,第下降*為明顯,僅剩0.07 ±0.01)kg/U。見表1。

2.3 IRB,ASP,IRB 聯合ASP MCAO 模型大鼠

組大鼠的大腦梗塞容積高達296.87 ± 24.10)mm3,第(159.72 ± 15.98)mm3 與第(164.09±17.64)mm3 則低於第1 組,而第組大鼠的梗塞容積*少僅(71.91±13.42)mm3。見表1。


2.4 IRB,ASP,IRB + ASP  MCAO 模型大鼠TBARS的影響

從檢測的結果來看,正常大鼠 TBARS 隻有217.19 ± 15.62) nM/g,接 MCAO 手術的大鼠TBARS 水平顯著升高,第 1~4 組統計結果依次為(571.15 ± 27.56),(315.42 ± 29.45),(332.13 ±31.94),(257.68±26.80)nM/g。見表1。



2.5 IRB,ASP,IRB+ASP MCAO 模型大鼠過氧化氫酶的影響

正常大鼠的過氧化氫酶水平為76.12±11.74) mU/mg 與之比較 ,第組大鼠的過氧化氫酶(29.37±4.07)mU/mg,活性明顯降低(P<0.05),第4組大鼠過氧化氫酶(63.56±5.82)mU/mg,活性略有下降 ,而 41.56 ± 5.51) mU/mg 與第40.09±5.95) mU/mg 過氧化氫酶活性略高於第 1 組。見表1。

2.6  1.1 IRB與ASP 的交互作用


簡單方差分析進一步證實,使用IRB、ASP 的確可以對大腦起到保護作用P<0.05)。但是IRB ASP 之間是否存在交互作用則有待商榷(自發活動率、抓力、梗塞容積,P>0.05;TBARS、過氧化氫酶, P<0.05)。見表2。




       3 討 論

隨著**譜的改變,腦卒中已成為成年人功能喪失的主要**之一5]。由於發病機製尚不明確, 所以腦卒中後的**效果並不甚理想6]。同時由於該**的**周期長、致病率高、易複發,給患者及其家庭造成了沉重的經濟和心理負擔,腦卒中的預防顯得尤為必要。

在本實驗中,污软件下载软件不要钱采用經典的MCAO 模型來模擬腦卒中的發生,並采集了五項指標的數據來反應腦卒中後大腦的損傷情況。其中自發活動率、抓力測試反應行為的改變,梗塞容積直觀的反應損傷範圍,而TBARS、過氧化氫酶則客觀的反應受損腦組織中氧化應激反應的程度。

腦卒中對大腦的影響是明顯的。被試大鼠的自發活動由每10 min(289.88±22.93)銳減到22.63± 2.83)次,而抓力也由0.64±0.12)kg/U   直降到0.07±0.01)kg/UIRB   ASP可以部分降低大腦血流中斷後運動腦組織的損傷,改善這種行為的偏失。通過TTC 染色播放高清视频不卡的播放器可以直觀的看到行單純MCAO 手術的大鼠大腦右半球大範圍白化,而提前給予 IRB、ASP 的大鼠損傷範圍則較小,IRB+ASP 組的大鼠損傷麵積是所有實驗組中*少的,僅為71.91 ± 13.42)mm3。TBARS 是反應脂質過氧化的一個重要指標。脂質過氧化反應在機體的新陳代謝過程中起著重要的作用,正常情況下與氧自由基反應處於協調與動態平衡狀態,一旦這種協調與動態平衡產生紊亂與失調,就會形成氧自由基連鎖反應,損害生物膜及其功能,以致形成細胞透明性病變、纖維化。過氧化氫是一種代謝過程中產生的廢物,它能夠對機體造成損害。為了避免這種損害,過氧化氫必須被快速地轉化為其他無害或毒性較小的物質。而過氧化氫酶就是常常被細胞用來催化過氧化氫分解的工具。實驗結果證實TBARS、過氧化氫酶的水平與大腦損傷程度相關,損傷越大,TBARS 水平越高而過氧化氫酶水平越低。至於IRB ASP 是否存在交互作用,目前難以定論,但是有一個現象值得注意,雖然自發活動率、抓力、梗塞容積三項較為宏觀的指標均不支持IRB ASP 存在交互作用,但是更為微觀的生化指標則提示IRB ASP 可以增強彼此的效應(表2);即便是自發活動率、抓力、梗塞容積三項指標,其統計圖中的藍線與綠線也未完全平行,尤其在是代表抓力與梗塞容積的統計圖中,兩線相交的趨勢更為明顯。

綜上所述,預防性給予IRB ASP,即便是短期用藥,也能對大腦起到保護性作用。降低腦組織的損傷,IRB 聯合ASP 的作用尤為顯著。多篇文獻報道服用ASP 可有效預防腦卒中的發生78,長期服用 IRB ASP 是否可以並在多大程度上降低腦卒中的發生值得進一步探討。在分析數據的過程中污软件不要不用会员發現單獨給予IRB、ASP 的效果無明顯差異,盡管兩種**的結構及藥理作用大相徑庭,但IRB ASP 預防腦卒中發生及降低腦損傷的作用是否別無二致則需要進一步研究來證實。總之,盡管在腦卒中病因發病機理、預防、**等領域還有許多謎團亟待解決,本研究也不失為一次有益的嚐試。

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