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水迷宮---慢性皮質酮注射誘導焦慮性抑鬱樹鼩模型的研究(一)


網絡出版時間: 2017  12  14 13: 50    網絡出版地址: http: / / kns cnki net / kcms / detail /34 1086  20171211 1848 058 html

◇實驗方法學◇

慢性皮質酮注射誘導焦慮性抑鬱樹鼩模型的研究(一)
吳夢瑤趙洪慶楊 琴柳 卓杜 青孟 盼韓遠山王宇紅



( 湖南中醫藥大學湖南省中藥粉體與**藥W省部共建國家重點實驗室培育基地湖南 長沙 410208)

doi: 10. 3969 / j. issn. 1001 - 1978. 2018. 01. 029

文獻標誌碼: A 文章編號: 1001  1978( 2018) 01  0141  05

中國圖書分類號: -332; 322. 81; 347; 363-332; 749. 41;

749. 72; R977. 11

摘要: 目 探討慢性皮質酮注射對近靈長類動物樹鼩焦慮和抑鬱樣行為的影響並進行藥W預見性評價建立新型   慮性抑鬱動物模型

方法 12 隻中緬樹鼩隨機分為正常組模型組和文拉法辛組每組 4 隻采用慢性皮質酮注射( ih27 mg·kg  1 21 d) 建立焦慮性抑鬱樹鼩模型文拉法辛組於造模同時灌胃給藥( 6 mg·kg  1 ) 采用自主活動評分糖水偏好測試Morris  水迷宮實驗評價樹鼩的焦慮和抑鬱行為表現; ELISA 試劑盒檢測樹鼩血漿 CRHACTHCOR 含量; HPLC-ECD  法檢測樹鼩腦內海馬杏仁核前額葉皮質的單胺遞質 5-HTNEDA  含量

結果與正常組比較模型組樹鼩自主活動評分糖水偏食度學習記憶能力均明顯下  降( P  0. 01 ) 血漿 CRHACTHCOR 含量明顯上升( P 0. 05) ,海馬杏仁核前額葉皮質 5-HTNEDA 含量降低( P 0. 05 ) ; 文拉法辛組樹鼩學習記憶能力得到改善血漿CRHCO 含量明顯降低( P  0. 05) ,各腦區 5-HTNEDA 含量上升( P  0. 05) 。結論 焦慮性抑鬱模型樹鼩具有明顯的 HPA 軸亢進及單胺遞質失調現象而文拉法辛能夠逆轉該現象說明該焦慮性抑鬱樹鼩模型具有藥W預見性 一種更接近人類臨床的新型焦慮性抑鬱動物模型

 

關鍵詞: 焦慮; 抑鬱; 樹鼩; 文拉法辛; HPA 軸; 單胺遞質; 皮質酮

 

焦慮性抑鬱症是一種重性抑鬱與焦慮共病的複合型精 神障礙J病具有精神運動遲滯致殘率及自S率高社會功 能損害重預後差等特征1]大量研究表明焦慮與抑鬱的 發病機製均涉及到神經遞質失調2]下丘腦 垂體 腎上腺( hypothalamic- pituitary- adrenaHPA) 軸紊亂神經營養缺乏等3然而焦慮性抑鬱J病的發病機製研究進展緩慢本課題組前期已建立焦慮性抑鬱大鼠模型4但考慮到該複合型J病的特殊性以及齧齒類動物與人類親緣關係的疏遠性 采用常規的齧齒類動物並不能完全滿足該J病的研究建立一種更能模擬焦慮性抑鬱臨床發病特點的合適模型對該病的防治尤為重要5]

因此本實驗擬采用近靈長類動物樹鼩6] 為研究對象 通過慢性皮質酮注射建立焦慮性抑鬱樹鼩模型研究焦慮性抑鬱模型樹鼩血漿促腎上腺皮質J素釋放J素( corticotropin releasing hormoneCH) 皮質醇( cortisolCO促腎上腺皮質J素( adrenocorticotrophic hormone,ACTH ) 及海馬杏仁核前額葉皮質的單胺遞質 5-羥色胺( 5-hydroxytryptamine5- HT) 去甲腎上腺素( norepinephrineNE) 多巴胺( dopamine DA) 含量的表達情況並采用臨床**該J病的一線用藥文拉法辛對模型樹鼩進行幹預進行藥W預見性研究確定模型的可行性為該病的臨床防治及抗焦慮性抑鬱新藥的研發提供有力的實驗基礎

1 材料與方法

1 1    動物    CL 級中緬樹鼩 12 隻體質量 130  150 g購自雲南昆明樹鼩種質資源中心飼養於湖南中醫藥大學**附屬醫院 SPF 級實驗動物中心SYXK( 湘) 2015-0003飼養於不鏽鋼籠具內室溫( 24 ± 2) ℃ 相對濕度( 50 ± 5) % 光/ 暗周期 12 h /12 h按實驗動物 3 原則給予人道關懷

1. 2    試劑與儀器     CRH、ACTH、CORT 試劑盒( 美國 R&D公司) ; 文拉法辛緩釋片( 成都康弘藥業) ; 皮質酮( 北京索萊寶生物公司) ; 5-HT、NE、DA 對照品( 中國藥品生物製品檢定所) 。Morris 水迷宮( 北京污软件不要不用会员生物科技公司) ; 動物行為學習記憶係統( 法國 Viewpoint 公司) ; MK-3 型酶標儀( 美國 Thermo Scientific 公司) ; 全自動勻漿機( 德國 IKA 公司) ; 1260 型高效液相色譜儀( 美國安捷倫公司) ; SDC 電化學檢測器( 荷蘭 Antec 公司) 。

1 3    造模及分組    12 隻樹鼩隨機分為 3 組: 正常組模型組文拉法辛組每組 4 隻正常組樹鼩正常飼養; 根據文獻報道的樹鼩對大鼠體表換算係數7模型組樹鼩每天給予皮質酮皮下注射( 27 mg·kg 1 ) ,持續 21 d; 文拉法辛組樹鼩於造模同時灌胃給予藥W文拉法辛( 6 mg·kg  1 1 d) 正常組和模型組給予等體積生理鹽水造模完成後進行行為學測試   試完成後將動物麻醉腹主動脈取血於冷凍台上分離出大   腦海馬杏仁核前額葉皮質丘腦等組織液氮中保存備用

1 4    行為學檢測

1 4 1    自主活動評分    造模結束後分析樹鼩的自主活動能力時間為 5 min。自主活動評分包括移動( 水平方向的位移) 和跳躍( 垂直方向的位移) ,將兩者次數相加表示各組樹鼩的相對活動能力

1 4 2    糖水偏好測試    各組樹鼩禁水 12  h 後每籠放置 2個水盒一個裝 100 mL 蔗糖水( 0. 029 mol·L  1 ) ,另一個裝等量的蒸餾水測定樹鼩在 6 h( 9 ∶ 00  15 ∶ 00) 內分別攝入蔗糖水和蒸餾水的體積並計算糖水偏好率( 糖水消耗體積/ 總消耗體積 × 100% ) 。

1 4 3    Morris 水迷宮實驗    水槽平均劃分為 ABCD 4 個象限用奶粉將水調成乳白色將平台置於水麵下 2  cm使其在實驗光線下對樹鼩不可見於實驗 d 17 開始對樹鼩進行適應性訓練即從平台象限的正對麵將樹鼩麵向池壁放入   水中 75 s 內未找到平台則將其牽引至平台處停留 10 s, 每天訓練 1 次持續4 d8]每次訓練結束後迅速用毛巾將樹鼩毛發擦幹以防止樹鼩低體溫

定位航行實驗: 訓練完成後將樹鼩從訓練位置麵向池壁放入水中觀察並記錄樹鼩爬上平台所需時間即逃避潛伏期( escape latencyEL) 考察其學習能力

探索實驗: 於實驗 d 21 撤除平台由同一入水點將樹鼩麵向池壁放入水中記錄 1 min 內樹鼩在平台所在象限的停留時間( stay timeST) 考察其記憶能力

1 5    HPA 軸指標含量測定    行為學測試完成後用****鈉( 40 mg·kg 1 ) 將動物麻醉腹主動脈取血收集於肝素鈉管中3 000 r·min  1 離心 15 min取血漿 80℃ 保存格按照 ELISA 試劑盒說明書檢測各組樹鼩血漿 CRHACTHCOR 的含量

1. 6    單胺遞質含量測定

1. 6 1    腦組織勻漿樣本製備    取冷凍保存的海馬杏仁核前額葉皮質精密稱重 1 ∶ 3 比例( 杏仁核為 1 ∶ 10) 分別

加入 0. 01 mol·L 1 高氯酸溶液( 內含 0. 03 mmol·L 1 ED-TA10 μg·L  1 內標 DHBA) 於冰上進行勻漿勻漿後 4℃ 13 000 r·min 1 離心 10 min 取上清 0. 22 μm 針頭過濾器過濾後進樣

1 6 2    色譜條件      色譜柱: Quattro 3  C18 柱( 150  mm × 2. 1

mm,3 μm) ; 流動相: 90 mmol·L  1 單水磷酸二氫鈉50 mmol·L  1 單水檸檬酸1. 7 mmol· L  1 辛烷磺酸鈉50 mol

·L 1 EDTA 的混合液 甲醇( 87 ∶ 13 ) ; 流速: 0. 2 mL · min 1 ; 柱溫: 35℃ ; 進樣量: 20 μL。

1 6 3    標準曲線繪製    精密稱取適量 5-HTNEDA 對照品溶於0. 01 mol·L 1 高氯酸溶液中配成 1 g·L 1 混合儲備液取適量體積的儲備液稀釋成 5  個梯度濃度點從低到高依次為

3. 1256. 2512. 52550 μg·L 1 將標準品溶液由低濃度至高濃度進樣進樣體積20 μL對色譜峰進行積分記錄峰麵積以濃度為橫坐標峰麵積為縱坐標繪製標準曲線( Fig 1) 。

7   統計學分析   采用 SPSS 17.  0 軟件進行統計分析驗數據以 x± s 表示組間差異比較采用單因素方差分析 兩兩比較方差齊時采用 LSD 檢驗法方差不齊時采用 Dun- netts T3 法進行分析



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